呼吸道病原體快檢賽道!CRISPR等新技術匯聚,革命正當時!
來源: IVD從業者網 2022年06月21日 10:23

此前,中國疾病預防控制中心在頂級期刊Nature communications發布了一項來自106個城市、277家哨點醫院和92個參考實驗室,歷時11年的呼吸道傳染病監測數據。在完善急性呼吸道感染的主動監控網絡的同時,確定引起中國人群的急性呼吸道感染的病因及其流行病學特征。這份來自國內呼吸道傳染病相關的大數據將常見的感染性病原體進行了系統的分析,也為呼吸道疾病的檢驗提供了參考。

病原體檢測和確證是呼吸道傳染病疫情防控的首要環節,呼吸道疾病往往起病比較急,因此快速、準確的檢測就顯得尤為重要。目前常用的檢測方法有基于檢測病原體特異性基因的核酸檢測技術、基于檢測病原體抗原或抗體的免疫檢測技術等,不同的技術各有優勢。

王升啟教授的《呼吸道傳染病病原體快速檢測新技術與研究開發重點》一文提到常見的呼吸道傳染病病原體檢測新技術和研究方向主要有以下幾個趨勢:

(1)熱門的病原體核酸檢測新技術

基于核酸擴增的技術具有靈敏、特異、快速等突出優點,被廣泛用于病原體檢測和臨床疾病診斷。目前最常用的核酸檢測技術為聚合酶鏈式反應(PCR)、等溫擴增技術、基因芯片技術等。

1. 雙鏈基因探針實時熒光PCR:實時熒光PCR是目前國際公認的病原體檢測應用最廣泛和穩定的分子檢測技術,在呼吸道傳染病病原體實驗室確證中具有不可替代的地位和作用。如獲批國家注冊證的新冠病毒核酸檢測產品中,90%以上采用的是實時熒光PCR技術。探針是實時熒光PCR技術的核心,根據熒光探針結構的不同,可分為以下幾種:水解探針、分子信標探針、雜交探針、蝎型探針及復合基因探針等,其中,復合基因探針具有熒光具有背景低、靈敏度高的突出優勢。


圖1. 復合基因探針的原理圖
2. 基于CRISPR的核酸檢測技術:近年來,CRISPR/Cas技術飛速發展,基于該技術發展的分子檢測方法具有快速、靈敏、特異、廉價等特性,已廣泛應用于生命科學領域,尤其在病原體檢測領域發展迅速。
目前用于呼吸道病原體檢測的主要有CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13等系統。CRISPR/Cas13檢測系統,張鋒等開發了一種基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術,為SARS-CoV-2提供了快速準確的診斷方法。通過使用合成的SARS-CoV-2的RNA片段,設計并檢測了2個可識別SARS-CoV-2特征的sgRNA,激活Cas13酶活性,切割報告分子,產生信號(圖3)。該技術最后需要將試紙條浸入反應體系中,通過辨識條帶位置的不同來確認是否感染SARS-CoV-2。

圖3. CRISPR/Cas13檢測系圖3. CRISPR/Cas13檢測系統
諾貝爾獎獲得者Doudna等報道了一種CRISPR/Cas13a和手機直接檢測新冠病毒的RNA的方法,這是一種簡便且便攜的檢測方法,實現從采樣到檢測的一體化。該裝置通用小型精簡的手機攝像頭進行熒光測試。此外,因為手機攝像頭具有高靈敏度、強連接性以及GPS和數據處理功能,所以這是一種可以應用到資源匱乏地區的實用工具,有助于即時檢測(圖4)。


圖4. 基于手機的CRISPR/Cas13核酸檢測系統

3. 基因芯片新技術:基因芯片又稱為DNA芯片、DNA微陣列,是生物芯片的一種,也是生物芯片技術中發展最成熟、最先進入應用和實現商品化的技術。
基因芯片技術是直接將DNA探針或者在固相支持物(如玻片、硅片、尼龍膜等)上原位合成寡核苷酸固定于支持物表面,然后與待分析的標記樣品雜交,標記的樣品通過于基因芯片上已知堿基序列的DNA片段互補雜交,從而得到樣品的遺傳信息,確定樣品的核酸序列,或對基因表達量及其特性進行分析。
當前,大多數基因芯片的顯像和分析方法都是基于有機熒光染料的激發熒光,該方法成熟、簡便,能夠達到一般的檢測要求,但有機熒光染料有自身難以克服的缺點:光淬滅、信號強度低、光譜重疊等,從而影響到檢測信號的靈敏性、均一性和重復性,信號檢測也依賴激光共聚焦掃描儀,體積笨重,價格昂貴。我國在臨床診斷用生物芯片產品研發領域處于國際領先地位,但生物芯片技術仍然沒有發揮其應有的應用價值。
為解決生物芯片技術檢測靈敏度低、操作步驟多、易污染等突出問題,我國研究者發明了高靈敏可視化生物芯片技術,研制出一種新的納米金復合底物Nanogold-DAB,HRP能夠直接催化此復合底物反應導致大量納米金顆粒特異沉積,從而建立了一種生物芯片的納米金復合底物高靈敏可視化檢測方法,
圖6表示了新型底物Nanogold-DAB的反應原理:納米金的NHS基團與DAB的一個氨基縮合反應形成酰胺鍵而得到Nanogold-DAB產物。該技術通過酶催化和銀離子還原顯色2次信號放大,靈敏度比傳統方法提高10倍以上。
同時,創新設計全封閉防污染芯片結構,成功研制了全新的自動化生物芯片檢測儀,實現了擴增、雜交、檢測和分析一體化?;诳梢暬镄酒夹g研制的流感病毒分型基因芯片獲得了首個可視化生物芯片產品的注冊證書。

圖6. Nanogold-DAB復合底物反應原理示意圖
二、免疫檢測新技術
免疫層析檢測技術以其操作便捷、成本低廉、檢測快速的特點,已廣泛應用于各類樣本中的小分子、生物大分子、病毒、細菌的快速檢測,成為目前應用范圍最廣的即時檢測技術之一。
納米標記材料是影響免疫層析檢測性能的關鍵,常用材料包括膠體金、熒光納米材料等。膠體金是免疫層析檢測技術最常用的檢測標簽,其檢測結果肉眼可見,無需使用讀數設備,適用于現場定性檢測。熒光納米材料包括有機熒光染料、量子點、上轉化發光納米粒子等,具有多通道定量檢測能力,其中量子點免疫層析、表面增強拉曼光譜免疫層析等新技術發展迅速。
1. 量子點免疫層析新技術:量子點(Quantum dots,QDs)是一種2~20nm尺寸的半導體納米材料,由于量子尺寸效應而具有帶隙能和熒光能尺寸可調的性質。典型的量子點材料為CdSe/ZnS核-殼結構,ZnS外殼可鈍化CdSe內核表面,防止內核氧化或分解。
與傳統的有機熒光探針相比,量子點具有無光致漂白作用,性質穩定,高量子效率;吸收光譜寬,發射光譜窄,可由單一光源激發多種波長量子點,具有多通道檢測能力的優點。采用量子點標記檢測代替傳統的膠體金標記技術,可實現具有高靈敏、多通道、定量檢測能力的熒光免疫層析技術。

2. 表面增強拉曼光譜(SERS)免疫層析技術:拉曼光譜是一種表征分子結構振動的指紋光譜,在表面科學、材料表征、痕量檢測、生命科學方面有著廣泛應用前景。
20世紀70年代,Fleischmann、Van Duyne和Creighton等發現吸附在粗糙銀電極表面或附近的分子的拉曼信號得到極大提高,即表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)。多種貴金屬增強基底可使吸附于其表面的分子SERS信號比普通拉曼信號增強104~107倍,并且貴金屬納米縫隙及納米尖端附近電磁場發生共振耦合,形成熱點(hot spot)效應,能夠產生強烈的SERS增強效應。
最近報道了磁免疫富集SERS免疫層析檢測呼吸道病毒的應用。單分散的Fe3O4磁核表面以帶正電的聚乙烯亞胺靜電吸附大量納米金顆粒作為種子還原一層銀殼,吸附拉曼報告分子,并共價偶聯修飾甲型流感病毒和腺病毒的抗體。功能化的磁性SERS標簽可實現從復雜樣本中免疫結合、磁富集病毒顆粒,并結合免疫層析試紙條,實現快速高靈敏的SERS檢測。通過磁富集和SERS增強雙重機制,使檢測限比膠體金法降低了2000倍。
文章摘自:王升啟教授《呼吸道傳染病病原體快速檢測新技術與研究開發重點》
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